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    人血小板型磷酸果糖激酶(PFKP)ELISA試劑盒

    發(fā)布時間: 2010-12-07  點擊次數(shù): 1181次

    預(yù)期應(yīng)用
    ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中PFKP含量。
     
    實驗原理
    用純化的PFKP抗體包被微孔板,制成固相載體,往微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的PFKP抗體、HRP標記的親和素,經(jīng)過*洗滌后用底物(TMB)顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的。顏色的深淺和樣品中的PFKP呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度( 值),計算樣品濃度。
     
    試劑盒組成及試劑配制
    1、 酶標板:一塊(96孔)
    2、 標準品(凍干品): 2瓶,請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后室溫靜置大約10分鐘,同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,其濃度為100 U/L,然后做系列倍比稀釋(注:不要直接在板中進行倍比稀釋),分別配制成100 U/L,50 U/L,25 U/L,12.5 U/L,6.25 U/L,3.12 U/L,1.56 U/L,樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制50 U/L標準品:取0.5ml (不要少于0.5ml )100 U/L的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。
    3、 樣品稀釋液:1×20ml。
    4、 檢測稀釋液A:1×10ml。
    5、 檢測稀釋液B:1×10ml。
    6、 檢測溶液A:1×120 /瓶(1:100)。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋(如:10 檢測溶液A / 990 檢測稀釋液A),充分混勻,稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制(100 /孔),實際配制時應(yīng)多配制  0.1-0.2ml。
    7、 檢測溶液B:1×120 /瓶(1:100)。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
    8、 底物溶液:1×10ml/瓶。
    9、 濃洗滌液:1×30ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
    10、終止液:1×10ml/瓶(2 mol/L H2SO4)。
    11、覆膜:5張
    12、使用說明書:1份
     
     
     
     
    自備物品
    1、 酶標儀(建議儀器使用前提前預(yù)熱)
    2、 微量加液器及吸頭,EP管
    3、 蒸餾水或去離子水,濾紙
     
    標本的采集及保存
    1、 血清:全血標本請于室溫放置2小時或4 過夜后于1000 g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
    2、 血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標本采集后30分鐘內(nèi)于 1000 g離心15分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
    3、 其它生物標本:請1000 g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保    存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
     
    注:以上標本均應(yīng)密封保存,4 保存應(yīng)小于1周,-20 不應(yīng)超過1個月,-80 不應(yīng)超過2個月;標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。
     
    操作步驟
    實驗開始前,各試劑均應(yīng)平衡至室溫,試劑不能直接在37 溶解;試劑或樣品配制時,均需充分混勻,混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量,如樣品濃度過高時,應(yīng)對樣品進行稀釋,以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
    1、 加樣:分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100 ,余孔分別加標準品或待測樣品100 ,注意不要有氣泡,加樣 時將樣品加于酶標板底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標板加上蓋或覆膜,37 溫育2小時。為保證實驗結(jié)果有效
    性,每次實驗請使用新的標準品溶液。
    2、 棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100 (臨用前配制),酶標板加上覆膜,37 溫育1小時。
    3、 棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板 3次,每次浸泡1-2分鐘,大約400 /每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。
    4、 每孔加檢測溶液B工作液(臨用前配制)100 ,加上覆膜,37 溫育1小時。
    5、 棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,方法同步驟3。
    6、 每孔加底物溶液90 ,酶標板加上覆膜37 避光顯色(反應(yīng)時間控制在15-30分鐘,當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色,后3-4孔梯度不明顯時,即可終止)。
    7、 每孔加終止溶液50 ,終止反應(yīng),此時藍色立轉(zhuǎn)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物    液的加入順序相同。
    8、 立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度( 值)。
     
    注:
    1、 試劑準備:所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫,使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實驗操作中請使用一次性的吸頭,避免交叉污染。
    2、 加樣:加樣或加試劑時,*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時間,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性。一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進行實驗。
    3、 溫育:為防止樣品蒸發(fā),實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi),以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進行下步操作,任何時侯都應(yīng)避免酶標板處于干燥狀態(tài);同時應(yīng)嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
    4、 洗滌:洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干,勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,同時要消除板底殘留的液體和手指印,避免影響zui后的酶標儀讀數(shù)。
    5、 試劑配制:Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理,以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用,并使用相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。請配制標準品及工作液,盡量不要微量配制(如吸取檢測溶液A時,一次不要小于10 ),以避免由于不準確稀  釋而造成濃度誤差;請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。
    6、 反應(yīng)時間的控制:加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如,每隔10分鐘),如顏色較深,請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),避免反應(yīng)過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。
    7、 底物:底物請避光保存,在儲存和溫育時避免強光直接照射。
        
    洗板方法
    1、 手工洗板方法:將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體,在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。
    2、 自動洗板:如果有自動洗板機,應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
     
    特異性
        本試劑盒可同時檢測重組或天然的人PFKP,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
     
    計算
      各標準品及樣本 值扣除空白孔 值后作圖(七點圖),如設(shè)置復(fù)孔,則 應(yīng)取其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標(對數(shù)坐標), 值為橫坐標(對數(shù)坐標),在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,如 curve expert 1.3,根據(jù)樣品 值,由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與 值計算出標準曲線的回歸方程式,將樣品的 值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。
     
    檢測范圍:1.56 U/L - 100 U/L,繪制標準曲線請取用以下濃度值:100 U/L,50 U/L,25 U/L,12.5 U/L,6.25 U/L,3.12 U/L,1.56 U/L。
     
    zui低檢測限:1 U/L
     
    說明
    1、  由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析,
        本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險。
    2、  zui終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關(guān),請務(wù)必
    準備充足的標本備份。
    3、 在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的   污染,因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。
    4、 試劑盒保存:請收到試劑盒后盡快將標準品、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20 ,其余試劑短期保存請置于4 ,長期保存則置于-20 。開封后的酶標板要密封加干燥劑后保存于-20 ,避免潮濕。
    5、 濃洗滌液會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。
    6、 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì),此為正?,F(xiàn)象,不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
    7、 有效期:6個月。
     
     

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