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實(shí)驗(yàn)原理
染色單體或染色體的無著絲點(diǎn)斷片,或因紡錘體受損而丟失的整個(gè)染色體,在細(xì)胞分裂后期,仍然在細(xì)胞質(zhì)中。末期之后,單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核,被包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi),因比主核小,故稱為微核。大小應(yīng)為主核的1/20~1/5。微核的折光率及細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣。微核率是和用藥的劑量或輻射累積效應(yīng)呈正相關(guān),所以可用簡(jiǎn)易的、快速、靈敏的微核計(jì)數(shù)來代替繁雜的畸變?nèi)旧w計(jì)數(shù)。Matter 和Schmid建立的微核測(cè)試是一種比較理想的方法,目前國內(nèi)外已把微核測(cè)試用于輻射損傷、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。
嗜多染紅細(xì)胞是分裂后期的紅細(xì)胞由幼年發(fā)展為成熟紅細(xì)胞的一個(gè)階段,此時(shí)紅細(xì)胞的主核已排出,因胞質(zhì)內(nèi)含有核糖體,Giemsa染色呈灰藍(lán)色,成熟紅細(xì)胞的核糖體已消失,被染成淡橘紅色。骨髓中嗜多染紅細(xì)胞數(shù)量充足,由于無核,極易觀察到微核,因此,骨髓中嗜多染紅細(xì)胞成為微核試驗(yàn)的細(xì)胞群。
實(shí)驗(yàn)對(duì)象
成年健康小鼠,體重25g左右,雌雄均可。
elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)試劑與器材
(1)器材:顯微鏡、低速離心機(jī)、電子天平、解剖器械(搪瓷解剖盤、探針、剪刀、鑷子)、注射器、試管、試管架、磨口試劑瓶、滴管、染色缸、洗耳球、量筒、清潔載玻片。
(2)試劑:0.9%生理鹽水、滅活的小牛血清、環(huán)磷酰胺、甲醇、PBS (pH6.8)、Giemsa染液、瑞氏染液。
實(shí)驗(yàn)方法與步驟
(1)環(huán)磷酰胺處理:取骨髓前24h先給小鼠腹腔注入環(huán)磷酰胺,注射劑量為100mg/kg動(dòng)物體重。
(2)取骨髓:用損傷脊髓法處死小鼠,然后用剪刀剪開大腿上的皮膚和肌肉,取出大腿骨,用一小塊紗布來回搓干凈附在骨上的肌肉碎渣。剪掉股骨兩端膨大的關(guān)節(jié)頭,然后用注射器吸取5ml生理鹽水,插入股骨一端,將骨髓細(xì)胞沖洗至10ml的離心管中。可重復(fù)沖洗多次,直至骨髓腔呈白色為止。
(3)離心處理:將所獲得的細(xì)胞懸浮液以 1000rpm離心10min,吸去上清液,在沉淀物中加入2滴滅活的小牛血清,制成細(xì)胞懸液。
(4)涂片:滴一滴懸液于載玻片一端,按常規(guī)方法涂片,在空氣中晾干。
(5)固定:將晾干的載玻片放入甲醇固定液中10min,取出晾干。
(6)染色:將制片平放在玻璃板上,用1∶9∶10的 Giemsa∶PBS∶瑞氏染液,染色15min,流水沖洗后晾干即可鏡檢。
(7)觀察:嗜多染紅細(xì)胞為年幼紅細(xì)胞,呈灰藍(lán)色,略大于紅細(xì)胞(紅色),微核多呈圓形和橢圓形,呈藍(lán)紫色或紫紅色(圖13-3)。
(8)結(jié)果分析:在顯微鏡下,每只小鼠骨髓涂片標(biāo)本計(jì)數(shù)1000~2000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞,包括其中出現(xiàn)微核的細(xì)胞數(shù),將結(jié)果填入表內(nèi),并計(jì)算微核細(xì)胞率,觀察記錄結(jié)果(表13-2)。
按100mg/kg體重劑量給小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺,其嗜多染紅細(xì)胞微核率為(48.9±3.6)%。正常小鼠嗜多染紅細(xì)胞微核率為5‰以下,超過5‰為異常。