服務熱線
021-54479081
021-54461587
ELISA是蛋白定量的金規(guī)范,也是免疫學研討中常用的試驗辦法之一。很多人覺得ELISA很簡單,其實不然。今天研域生物帶你繞開ELISA試驗中呈現的各種問題,輕松搞定ELISA試驗~
1.間接法
檢測抗體常用的辦法, 首要用于對病原體抗體的檢測。
優(yōu)勢:二抗能夠加強信號,并且有多種挑選能做不同的測定剖析。不加酶符號的一級抗體則能保存它多的免疫反應性。
缺點:交互反應發(fā)生的機率較高
2.雙抗體夾心法
檢測大分子抗原常用的辦法。
優(yōu)勢:高活絡、高專一性,抗原無須事前純化。
缺點:抗原必定得具有兩個以上的抗體結合部位。
3.競爭法
檢測小分子半抗原(藥物、激素等)。
優(yōu)勢:可適用比較不純的樣本,并且數據再現性很高。
缺點:整體的敏感性和專一性都較差。
常見問題剖析
Q1.標曲不顯色或顯色很弱,樣本顯色
溶解規(guī)范品以及倍比稀釋時,未渦旋震動或不行充沛。
規(guī)范品溶解、倍比稀釋時均需求渦旋震動以保證充沛混勻。單純依托移液器重復吹打,效率較低、作用也不必定jia。
Q2.標曲和樣本均不顯色
在孵育階段靜置在桌面上,這樣非常不利于抗原抗體之間的充沛接觸,導致顯色偏弱。
推薦孵育階段,運用ELISA的微孔板振蕩器,調至適宜的頻率,使抗原抗體充沛接觸,保證結合作用。假如排除上述原因,有可能是漏加了某個組分,如檢測抗體、酶等。關于比較大意的新手,必定要做好符號和記錄,或者運用增加染料的ELISA試劑盒。
Q3.標曲顯色,樣本不顯色
當樣本中意圖蛋白濃度極低或者樣本中攪擾要素較強,就無法檢測到?,F在ELISA仍然是蛋白檢測活絡度gao的辦法,與不同技能結合后,衍生出了多種類型的ELISA,提高了檢測活絡度。
關于意圖蛋白濃度特別低的樣本,能夠嘗試用高敏ELISA,但這也并不意味著必定能檢測到樣本濃度,只能說能夠提高樣本的可測率,并使成果愈加牢靠。因為通常用一般ELISA檢測的樣本OD值都偏低,而高敏ELISA可提高樣本OD值,使之盡量位于標曲范圍內,得到的數值也愈加可信。
Q4.標曲和樣本都顯色,但復孔的CV大
這個問題就跟移液器和試驗者的操作有關了。移液器的運用維護不規(guī)范,就會造成移液的誤差較大;試驗者自身的操作習慣、加樣的一致性對復孔的CV也有很大影響。
掌握移液器的正確運用和維護。關于個人的操作可操練移液動作、加快速度,保證移液的精密度。
Q5.本底偏高,樣本值測不到標曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(關于高敏ELISA能夠恰當放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時分,本底過高會掩蓋意圖信號,導致無法測到樣本值。
在參加TMB顯色后,需實時觀察標曲顯se狀況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍色,即可停止反應。
Q6.樣本經不同梯度稀釋,核算得到的樣本值差異較大
有時分咱們不清楚樣本中意圖蛋白的濃度怎么,應該怎么稀釋,那么咱們就會做下預試驗,確認稀釋倍數。但是有時分同一樣本做了幾個不同梯度稀釋后,核算得到的樣本值之間差異較大,應該挑選哪一個稀釋倍數呢?
這里觸及到了基質效應。通常血清樣本加樣量較高時,血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體的接觸,基質效應較顯著。而經過稀釋后,攪擾要素也隨之稀釋,影響就會較小。當某兩個梯度稀釋后,核算得到的樣本值挨近時,咱們就能夠以為在該稀釋梯度時,樣本中的攪擾要素影響較小,核算得到的值也是挨近真實的。但是這樣的稀釋是針對意圖蛋白濃度較高的樣本而言。關于濃度很低的樣本,經過多倍稀釋后,就愈加測不到了,此刻可依照廠家說明書推薦的加樣方法操作。
Q7.不同試劑盒中的組分能否通用
除非是共用的試劑如洗液、檢測緩沖液,其它組分不建議用其它試劑盒的組分,乃至是同一指標不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包含規(guī)范品、規(guī)范品稀釋液、檢測抗體、酶等)都是經過優(yōu)化的,假如輕率運用其它試劑盒的組分,有可能對成果產生影響。