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我們在做一項試驗的時候,需要了解的過程與所需物品是*的。而今天,我司在這里要給朋友們共享的便是試驗制得細胞的樣本,您需做好下文中的這六步兩留意。所謂的六步兩留意也便是操作的六個過程,和兩條留意事項,下面我們就來具體的看看吧。
試驗之前,我公司的技術人員為朋友們特別準備說明晰所需的物品有哪些:
1、培養(yǎng)基;不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基
2、處理玻片:將多聚賴氨酸溶液(溶于1mol/L pH7.0 Tris-HCl緩沖液中),涂布于玻片上,枯燥后即可使用?;蛟SAPES 2ml溶于100ml丙酮中,將玻片浸泡入內,取出晾干,180℃枯燥備用。
3、洗刷液;0.1M,pH7.2~7.4PBS
4、細胞固定液:4%多聚甲醛0.1MPBS(pH7.2~7.4)含有1/1000 DEPC。
5、乙醇:70% 90% 100%
6、胃蛋白酶溶液:用0.1N HCl將其稀釋為100μg/ml
7、設備:烤箱,CO2培養(yǎng)箱,倒置顯微鏡,玻璃載玻片,原位雜交蓋玻片,溫箱,加樣器和吸頭等。
操作過程:
1、在37℃ 5% CO2條件下將細胞加在處理的載玻片上,用培養(yǎng)基培養(yǎng),時間經(jīng)過預試驗確定;
2、細胞長好后,用洗刷液洗2分鐘×3次,室溫下將其放入細胞固定液中固定30-60min,蒸餾水洗刷;
3、室溫下用洗刷液充分洗刷固定細胞,(枯燥后-20℃冰凍保存2周以上)
4、雜交前將固定的細胞進行如下處理;順次在70%,90%,100%的乙醇中浸泡,脫水每次5min,用二甲苯洗刷,除掉殘留脂質順次在100%,90%,70%乙醇中浸泡,進行再水化,每次5min,zui后浸泡于洗刷液中;
5、在37℃用胃蛋白酶溶液10min處理固定的細胞,以添加細胞對大分子試劑的通透性,再用洗刷液洗5min;
6、用1%甲醛固定10min,用洗刷液洗凈。
留意!
1、所有溶液都必須用RNA酶按捺劑處理。
2、操作中重要的是及時固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC處理,以按捺RNA酶對mRNA的分解效果。此外,過度固定對原位雜交有顯著的不利影響。