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PCR:聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR),一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,PCR的大特點,是能將微量的DNA大幅增加。PCR的原理:PCR的基本過程類似于DNA的天然復制,特異性依賴于與靶序列兩端互補的Oligo引物。整個過程由變性-退火-延伸3個基本反應步驟構成。
PCR實驗中擴增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散的原因如下:
(1)酶量過高。減少酶量;酶的質量差,調換另一來源的酶。
(2)dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。
(3)MgCl2濃度過高??蛇m當降低其用量。
(4)模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng,而基因組DNA則應<200ng。
(5)引物濃度不夠優(yōu)化。對引物進行梯度稀釋重復PCR反應。
(6)循環(huán)次數(shù)過多;增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30,縮短退火時間及延伸時間,或改用二種溫度的PCR循環(huán)。
(7)退火溫度過低。
(8)電泳體系有問題:
①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大;
②凝膠沒有凝固好;
③瓊脂糖質量差。
(9)若為PCR試劑盒則可能:
①由于運輸儲存不當引起試劑盒失效;
②試劑盒本身質量有問題,如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當。
(10)降解的陳舊模板擴增也易產(chǎn)生涂布。