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    間接ELISA檢測(cè)鴨瘟病毒

    發(fā)布時(shí)間: 2011-11-03  點(diǎn)擊次數(shù): 1468次

    間接ELISA檢測(cè)鴨瘟病毒
    ①包被抗原的制備。取種毒適量,按2000u/ml加入雙抗,接種12日齡番鴨胚,接種量o,2ml/個(gè),放人溫箱內(nèi)孵化,逐日照胚,連續(xù)培養(yǎng)5天,收集接種后48—120h內(nèi)死亡,胚體有典型病變的鴨胚尿囊液,8000r/min離心20min,取上清液,加入等量飽和硫酸銨,使其終濃度達(dá)50%飽和度,用玻棒攪拌均勻,置4℃過(guò)夜。次日把溶液混勻,10000r/min4℃離心30rain,沉淀用StolpH 7,4 PBS溶解,裝入透析袋內(nèi),用PBS透析。磁力攪拌器攪拌90min后置4℃過(guò)夜,期間換液4次。用10%BaCl2檢測(cè)透析液中有無(wú)SO42-,直至檢測(cè)不出SO42-為止。病毒液一20~C凍存?zhèn)溆?。用常?guī)方法處理SephadexG—200裝柱,取硫酸銨粗提的病毒樣品加在柱床上面,待病毒液全部進(jìn)入柱床后用PBS洗脫,控制流速o.5mi/113.111,收集20管,每管5ml,722分光光度計(jì)測(cè)定各管的OD280和OD260值,依據(jù)公式蛋白濃度(mg/rnl)=1.45 OD280一0.74OD260。計(jì)算各管的蛋白濃度,以蛋白濃度為縱坐標(biāo),試管號(hào)為橫坐標(biāo),繪制洗脫曲線,并計(jì)算每管的OD280/OD260,把比值大于1的各試管合并,用60%PEG-6000濃縮后再測(cè)定其蛋白濃度,作為包被抗原。
    間接ELISA檢測(cè)鴨瘟病毒
    ②間接ELISA*反應(yīng)條件的選擇。
    酶標(biāo)抗體*工作濃度測(cè)定 參照文獻(xiàn)的方法提取健康鴨血清IgG,透析除鹽,再經(jīng)SephadexG—25柱進(jìn)一步除鹽,共收集lo管,于280nm波長(zhǎng)處測(cè)各管的OD值,繪制洗脫峰曲線,取蛋白吸收峰高的幾管合并,分光光度計(jì)測(cè)其蛋白濃度。以o.05mol/LpH 9.6碳酸鹽緩沖液將鴨IgG稀釋至100bg/mi,于酶標(biāo)板的每孔中加入100/~L,置濕盒中4~C過(guò)夜。取出反應(yīng)板,洗液(PBS—T,含0.05%tween 20的PBS洗滌3~5遍,拍干。加封閉液(含0.5%BSA的PBS-T),100iLL/孔,室溫作用2L,洗滌3—5遍,拍干。以稀釋液(含0,1%BSA的PBS-T)將酶標(biāo)抗體作1:100、l:200、1:400、l;800等一系列稀釋?zhuān)来渭尤敫餍】字?,每個(gè)稀釋度加兩孔,每孔100t~L,室溫作用5h,洗滌。加底物溶液(OPI~Hz02,室溫避光20min,加入2mol/L H2SO:終止反應(yīng),50t~L/{L。490nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值,以能產(chǎn)生光密度為1.o的稀釋度為酶標(biāo)抗體的zui適濃度。間接ELISA檢測(cè)鴨瘟病毒
    抗原和血清*稀釋度的選擇 采用方陣滴定法確定抗原和血清的*工作濃度用0.05mol/LpH 9.6碳酸鹽緩沖液將抗原作1:10、1;20、1:40、1:80、l:160、1:320稀釋?zhuān)謩e加入到酶標(biāo)板的第1列至第12列,每個(gè)稀釋度加兩孔,每孔100/mL,37~C作用1h,轉(zhuǎn)入4~C過(guò)夜;次日洗滌后封閉,再洗滌;用含o.1%BSA的PBS—T將陰、陽(yáng)血清作1:20、㈠40、1:80、1:60稀釋?zhuān)?yáng)性血清的4個(gè)稀釋度依次加入到酶標(biāo)板的1行、3行、5行、7行,陰性血清的4個(gè)稀釋度依次加入到酶標(biāo)板的2行、4行、6行、8行,每孔1001LL,置濕盒內(nèi)37~C作用1h,再洗滌;加人1:400工作濃度的酶標(biāo)抗體,37℃1h,洗滌;加底物溶液,室溫閉光30min;加終止液,490nm測(cè)其OD值。以尸/Nzui大者所對(duì)應(yīng)的抗原和血清稀釋度作為抗原*包被濃度和血清*工作濃度。
    ELISA反應(yīng)溫度和間隔時(shí)間的選擇 a,抗原吸附時(shí)間和溫度:抗原包被后分別以37~C 1h轉(zhuǎn)入4~C過(guò)夜和直接37~C 5h吸附,對(duì)8份血清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè),測(cè)定OD值。b.封閉液封閉時(shí)間和溫度、血清反應(yīng)時(shí)間和溫度、酶標(biāo)抗體工作時(shí)間和溫度的確定均選擇37~C 1h,37~C 2h、室溫2h三種條件,對(duì)4份效價(jià)較高的血清樣品進(jìn)行ELISA檢測(cè),比較它們的OD值差異。c底物zui適作用時(shí)間的確定:以zui適稀釋度抗原、血清和酶標(biāo)抗體進(jìn)行試驗(yàn),加入底物后分別在室溫10min、20min、30rain終止反應(yīng),比較其OD值差異。陰陽(yáng)性血清臨界值的確定 采集從1日齡飼養(yǎng)至28天,未作任何疫苗免疫的健康鴨血清30份,分別與等量鴨胚液混合,室溫作用2L,高速離心,取上清液作為陰性血清。測(cè)定30份血清的OD值,以O(shè)D平均值加上3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差作為判定臨界值,受檢血清高于此值即判為陽(yáng)性。

    ③間接EIASA操作程序a.以zui適濃度的抗原包被反應(yīng)板,100rtl/孔,37~C 1h轉(zhuǎn)人4~C過(guò)夜,次日洗板3—5次,每次5min,拍干。b.以含O.5%BSA的PBS—T封閉,37~Clh,洗板3—5次。c.加入zui適稀釋度的待檢血清,37~C 1h,洗板。d.加入zui適工作濃度的酶標(biāo)抗體,37~C 1h,洗板。e.加入底物,室溫避光30min。f.加入終止液,50ul/孔 g.490nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。
     

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