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在ELISA中,進(jìn)行各項實(shí)驗條件的選擇是很重要的,其中包括:
(1)固相載體的選擇: 許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體,在使用前均可進(jìn)行篩選:用等量抗原包被,在同一實(shí)驗條件下進(jìn)行反應(yīng),觀察其顯色反應(yīng)是否均一性,據(jù)此判明其吸附性能是否良好。
(2)ELISA試劑盒包被抗體(或抗原)的選擇: 將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時,要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0~9.6之間。吸附溫度,時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4C18~24小時。蛋白質(zhì)包被的合適濃度需進(jìn)行滴定: 即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/m1等)進(jìn)行包被后,在其它試驗條件相同時,觀察陽性標(biāo)本的OD值。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1~10μg/m1。
(3)酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇: 首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價的滴定(見酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法"(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。
(4)ELISA試劑盒的酶的底物及供氫體的選擇: 對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng),而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用,應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后,應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間,以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,尤其是H202在臨用前加入。