發(fā)布時(shí)間: 2013-08-27 點(diǎn)擊次數(shù): 1015次
檢測(cè)原理:
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗小鼠FMS樣酪氨酸激酶3配體 (Flt-3L)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒包被于酶標(biāo)板上,實(shí)驗(yàn)時(shí)標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品中的Flt-3L會(huì)與包被抗體結(jié)合,游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗小鼠Flt-3L抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素??剐∈驠lt-3L抗體與結(jié)合在包被抗體上的小鼠Flt-3L結(jié)合、生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物,游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB),TMB在辣根過氧化物酶的催化下現(xiàn)藍(lán)色,加終止液后變黃。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值,F(xiàn)lt-3L濃度與OD450值之間呈正比,通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中Flt-3L的濃度。
標(biāo)本收集:
1. 血清:全血標(biāo)本于室溫放置2小時(shí)或4℃后于1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè),收集
血液的試管應(yīng)為一次性的無(wú)熱原,無(wú)內(nèi)毒素試管。
2. 血漿:抗凝劑推薦使用EDTA.Na2,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘,取上清即可
檢測(cè)。避免使用溶血,高血脂標(biāo)本。
3. 組織勻漿:用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,以去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞
會(huì)影響測(cè)量結(jié)果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣本對(duì)應(yīng)9mL的PBS,具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復(fù)凍融。zui后將勻漿液于5000×g 離心5~10分鐘,取上清檢測(cè)。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘,除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測(cè)。|
5. 其它生物標(biāo)本:1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè)
6. 標(biāo)本應(yīng)清澈透明,懸浮物應(yīng)離心去除。
7. 標(biāo)本收集后若不及時(shí)檢測(cè),請(qǐng)按一次使用量分裝,凍存于-20℃/-80℃冰箱內(nèi),避免反復(fù)凍融,
1-6月內(nèi)檢測(cè),4℃保存的應(yīng)在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。
8. 如果您的樣本中檢測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品zui高值,請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況,做適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建議先做
預(yù)實(shí)驗(yàn),以確定稀釋倍數(shù))。
試驗(yàn)所需自備物品:
1. 酶標(biāo)儀(450nm波長(zhǎng)濾光片)
2. 高精度移液器,EP管及一次性吸頭:0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3. 37℃恒溫箱, 雙蒸水或去離子水 4. 吸水紙
檢測(cè)前準(zhǔn)備工作:
1. 請(qǐng)?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒,平衡至室溫。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)
晶,屬于正常現(xiàn)象,可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶*溶解后再配制洗滌液(加熱溫度不要超過50℃,使用時(shí)洗滌液應(yīng)為室溫)。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中,靜置10分鐘,待其充分溶解后,
輕輕混勻(濃度為1000pg/mL)。然后根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋(注:不要直接在反應(yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋)。建議配制成以下濃度: 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、0 pg/mL ,樣品稀釋液直接作為空白孔0pg/mL。如配制500pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5mL 1000pg/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5mL樣品稀釋液的EP管中,混勻即可,其余濃度依此類推。
4. 生物素化抗體工作液:實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量(以100μL/孔計(jì)),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配
制100-200μL。使用前15分鐘,以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作濃度。當(dāng)日使用。
5. 酶結(jié)合物工作液:實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量(以100μL/孔計(jì)),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制100-200μL。使用前15分鐘,以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。當(dāng)日使用。
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例:(以500μL/管為例,也可根據(jù)實(shí)際用量來稀釋,如200μL/管)
操作步驟:
實(shí)驗(yàn)開始前,各試劑均應(yīng)平衡至室溫;試劑或樣品配制時(shí),均需充分混勻,并盡量避免起泡。
1. 加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μL,余孔分別加標(biāo)
準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μL,注意不要有氣泡,加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。給酶標(biāo)板覆膜,37℃孵育90分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2. 棄去液體,甩干,不用洗滌。每個(gè)孔中加入生物素化抗體工作液100μL(在使用前15分鐘內(nèi)配制),酶標(biāo)板加上覆膜,37℃溫育1小時(shí)。
3. 棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板 3次,每次浸泡1-2分鐘,大約350μL/每孔,甩干并在吸水
紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
4. 每孔加酶結(jié)合物工作液(臨用前15分鐘內(nèi)配制)100μL,加上覆膜,37℃溫育30分鐘。
5. 棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,方法同步驟3。
6. 每孔加底物溶液(TMB)100μL,酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光孵育15分鐘左右(根據(jù)實(shí)際顯
色情況酌情縮短或延長(zhǎng),但不可超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí),即可終止)。 7. 每孔加終止液50μL,終止反應(yīng),此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。
8. 立即用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD值)。應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀電源,預(yù)熱儀器,設(shè)置好檢測(cè)程序。
9. 實(shí)驗(yàn)完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存。
注意事項(xiàng):
1. 保存:試劑盒中各試劑請(qǐng)按說明書提示合理存放。在儲(chǔ)存及溫育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染,否則可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。
2. 酶標(biāo)板:剛開啟的酶標(biāo)板孔中可能會(huì)有少許水樣物質(zhì),此為正?,F(xiàn)象,不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。
3. 加樣:加樣或加試劑時(shí),*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔的加樣時(shí)間間隔如果太大,將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時(shí)間,從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。每次的加樣時(shí)間控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔。
4. 溫育:為防止樣品蒸發(fā),實(shí)驗(yàn)時(shí)必須給酶標(biāo)板覆膜;洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。
5. 洗滌:洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干,勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水。在讀數(shù)前要注意清除底部殘留的液體和手指印,以免影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。
6. 小鼠FMS樣酪氨酸激酶3配體 (Flt-3L)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒試劑配制:Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較小,運(yùn)輸過程會(huì)使液體沾到管壁或瓶蓋,因此使用*0轉(zhuǎn)/分離心1min,以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前,請(qǐng)用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液請(qǐng)根據(jù)所需用量配制,并使用相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。請(qǐng)配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,盡量不要微量配制(如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab時(shí),一次不要小于10μL),以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成濃度誤差;請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液。若需要分次使用標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按照每一次用量分裝,將其放在-20~-80℃貯存。避免反復(fù)凍融。
7. 顯色時(shí)間的控制:加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如每隔5分鐘),如梯度已很明顯,請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),避免顏色過深影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。
8. 底物:底物請(qǐng)避光保存,在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
9. 混勻:充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要,使用微量振蕩器(使用zui低頻率),如無(wú)微量振蕩器,可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。
10. 安全:試驗(yàn)中請(qǐng)穿著實(shí)驗(yàn)服并帶乳膠手套做好防護(hù)工作。特別是檢測(cè)血液或者其他體液標(biāo)本時(shí),請(qǐng)按國(guó)家生物試驗(yàn)室安全防護(hù)條例執(zhí)行。
11. 不同批號(hào)的試劑盒組份不能混用(洗滌液和反應(yīng)終止液除外)
12. 試驗(yàn)中所用的EP管和吸頭均為一次性使用,嚴(yán)禁混用,否則將影響試驗(yàn)結(jié)果!
結(jié)果判斷:
1. 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值減去空白孔的OD值后作圖,如設(shè)置復(fù)孔,則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。亦可以O(shè)D值為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2. 推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件,如curve expert 1.3,在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值,由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,乘以稀釋倍數(shù);亦可將樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。
3. 若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè),計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
靈敏度、檢測(cè)范圍、特異性和重復(fù)性:
● 靈敏度:zui小可測(cè)9.38pg/mL。
● 檢測(cè)范圍:15.63 – 1000pg/mL。
● 特異性:可檢測(cè)重組或天然的小鼠Flt-3L,且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。
● 重復(fù)性:板內(nèi),板間變異系數(shù)均<10%。
問題分析
問題描述 可能原因 相應(yīng)對(duì)策
標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度差
吸液或加液不準(zhǔn) 檢查移液器及吸頭
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不正確 溶解標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)稍微旋轉(zhuǎn)瓶身,輕輕混勻使粉末*溶解 洗滌不*
保證洗滌時(shí)間和洗滌次數(shù)及每孔的加液量 顯色很弱或無(wú)色
孵育時(shí)間太短 保證充足的孵育時(shí)間 實(shí)驗(yàn)溫度不正確 使用推薦的實(shí)驗(yàn)溫度
試劑體積不夠或漏加 檢查吸液及加液過程,保證所有試劑按順序足量添加
稀釋不正確
讀數(shù)數(shù)值低
酶標(biāo)儀設(shè)置不正確
在酶標(biāo)儀上檢查波長(zhǎng)及濾光片設(shè)置 提前打開酶標(biāo)儀預(yù)熱 曲線偏差大 加液不正確
檢查加液情況 背景值高
檢測(cè)抗體的工作濃度過高 使用推薦的稀釋倍數(shù)
酶標(biāo)板洗滌不*保證清洗*;如果用自動(dòng)洗板機(jī),請(qǐng)檢查所有的出口是否有堵塞 洗液有污染
配制新鮮的洗液
靈敏度低
ELISA試劑盒保存不當(dāng) 按說明書要求保存相關(guān)試劑 讀數(shù)前未終止
OD讀數(shù)前應(yīng)在每孔中加入終止液
說明
1. 限于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平,尚不能對(duì)所有原料進(jìn)行全面的鑒定分析,本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。
2. zui終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān),請(qǐng)務(wù)必準(zhǔn)備充足的待測(cè)樣品。
3. 小鼠FMS樣酪氨酸激酶3配體 (Flt-3L)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒只有全部使用ElabTM試劑才能保證檢測(cè)效果,不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守ElabTM試劑的實(shí)驗(yàn)說明才會(huì)得到*的檢測(cè)結(jié)果。
4. 有效期:6個(gè)月。
5. 本操作說明同樣適用于48T試劑盒。