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1.RNA的提取
RNA的提取其實(shí)原理很簡單:通過變性劑破碎細(xì)胞或者組織,然后經(jīng)過氯仿等有機(jī)溶劑抽提RNA,再經(jīng)過沉淀,洗滌,晾干,zui后溶解。但是由于RNA酶無處不在,隨時(shí)可能將RNA降解,所以實(shí)驗(yàn)中有很多地方需要注意,稍有疏忽就會前功盡棄。
1.1分離高質(zhì)量RNA
成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑,如EDTA或SDS。RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的zui大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍/酸性酚的一步法。
一般不必使用oligo(dT)選擇性分離poly(A)+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly(A)+RNA,都可以檢測到擴(kuò)增結(jié)果。另外,分離poly(A)+RNA會導(dǎo)致樣品間mRNA豐度的波動變化,從而使信息的檢出和定量產(chǎn)生偏差。然而,當(dāng)分析稀有mRNA時(shí),poly(A)+RNA會增加檢測的靈敏度。
1.2RNA提取的zui大影響因素-RNA酶
在所有RNA實(shí)驗(yàn)中,zui關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定,可耐受多種處理而不被滅活,如煮沸、高壓滅菌等,RNA酶催化的反應(yīng)一般不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解,而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果,所以RNA的制備與分析操作難度很大。
在實(shí)驗(yàn)中,一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要zui大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等,也可存在于灰塵中。在其它分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細(xì)胞中則含有大量內(nèi)源性的RNA酶。
1.3常用的RNA酶抑制劑
*焦碳酸二乙酯(DEPC):是一種強(qiáng)烈但不*的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性,從而抑制酶的活性。
*異硫氰酸胍:目前被認(rèn)為是zui有效的RNA酶抑制劑,它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來,又對RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。
*氧釩核糖核苷復(fù)合物:由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物,它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì),幾乎能*抑制RNA酶的活性。
*RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin):從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑,可以和多種RNA酶結(jié)合,使其失活。
*其它:SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。
1.4防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和準(zhǔn)備的工作
*盡可能在實(shí)驗(yàn)室專門辟出RNA操作區(qū),離心機(jī)、移液器、試劑等均應(yīng)。RNA操作區(qū)應(yīng)保持清潔,并定期進(jìn)行除菌。
*操作過程中應(yīng)始終戴一次性橡膠手套和口罩,并經(jīng)常更換,以防止手、臂上的細(xì)菌和真菌以及人體自身分泌的RNase帶入各種容器內(nèi)或污染用具。盡量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不僅常常給操作帶來不便,而且塑料手套的多出部分常常將器具有RNase處傳遞到RNase-free處,擴(kuò)大污染。
*盡量使用一次性的塑料制品,避免共用器具如濾紙、tips、tubes等,以防交叉污染。例如,從事RNA探針工作的研究者經(jīng)常使用RNaseH、T1等,在操作過程中極有可能造成移液器、離心機(jī)等的污染。而這些污染了的器具是RNA操作的大敵。
*關(guān)于一次性塑料制品,建議使用廠家供應(yīng)的出廠前已經(jīng)滅菌的tips和tubes等。多數(shù)廠家供應(yīng)的無菌塑料制品很少有RNase污染,買來后可直接用于RNA操作。用DEPC等處理的塑料制品,往往由于二次污染而帶有RNase,從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。
*所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時(shí)間。
*無法用DEPC處理的用具可用氯仿擦拭若干次,這樣通??梢韵齊Nase的活性。
*配制溶液用的乙醇、異丙醇、Tris等應(yīng)采用未開封的新瓶裝試劑。
*塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗(注意:有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕,故不能使用)。
*有機(jī)玻璃的電泳槽等,可先用去污劑洗滌,雙蒸水沖洗,乙醇干燥,再浸泡在3%H2O2室溫10min,然后用0.1%DEPC水沖洗,晾干。
*配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1%DEPC,在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑,應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制,然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。
1.5RNA提取的一般步驟
RNA提取的一般步驟是:破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA
破碎組織和滅活RNA酶可以同步進(jìn)行,可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織,加入β-ME可以抑制RNA酶活性。
分離RNA一半用酚、氯仿等有機(jī)溶劑,加入少量異戊醇,經(jīng)過此步,離心,RNA一般分布于上層,與蛋白層分開。
沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc(pH-5.2)或異丙醇。
洗滌RNA使用70%乙醇洗滌,有時(shí),為避免RNA被洗掉,此步可以省掉,洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇,但是不能過于干燥,否則不易溶解。融解RNA一般使用TE。
保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染,從富含RNase的樣品(如胰臟、肝臟)中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA,對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA,在水中貯存一個星期就基本降解了,而從大鼠脾臟中提取的RNA,在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外,長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性,可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時(shí),可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaAc至0.3M,12,000×g離心5分鐘。
1.6RNA抽提新方法-TRIZOL法
TRIZOL試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心,樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后,RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后,樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA,在有機(jī)層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化DNA對于樣品間標(biāo)準(zhǔn)化RNA的產(chǎn)量十分有用。
TRIZOL是有毒物,接觸皮膚或者不慎吞服,會導(dǎo)致灼傷,一旦接觸皮膚后立即以大量的洗滌劑和清水清洗。TRIZOL在室溫下能穩(wěn)定保存12個月。盡管如此,為達(dá)到*效果,建議保存在2-8°C的環(huán)境下。
2.RT-PCR
RT-PCR是指將逆轉(zhuǎn)錄(ReverseTranscription;RT)反應(yīng)和PCR(PolymeraseChainReaction)反應(yīng)組合在一起的方法。
2.1RT-PCR的原理
RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起,提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對表達(dá)信息進(jìn)行檢測或定量。另外,這項(xiàng)技術(shù)還可以用來檢測基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù),更靈敏,更易于操作。
RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶,以隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性的引物(GSP)起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中,每一步都在*條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行,然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。在一步法RT-PCR中,逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下,在一只管中順次進(jìn)行。
2.2RT-PCR的步驟
?、旁诒‰x心管里面加入模板RNA4uL,引物2uL,去離子水5uL,混勻,離心3-5秒;
?、?0度水浴5分鐘,冰浴30秒(此處是為了使引物和模板正確配對);
?、羌尤?×反應(yīng)液4uL,RNase抑制劑1uL,dNTP2uL(這些應(yīng)該先配好,然后分再裝到每一管),混勻;
?、?7度水浴5分鐘,加入1uLAMV-RT反轉(zhuǎn)錄酶,混勻;
?、?7度水浴1小時(shí)(此步是反轉(zhuǎn)錄過程);
⑹70度10分鐘結(jié)束反應(yīng)(此處是滅活酶活性,避免對后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾),產(chǎn)物置冰上進(jìn)行下一步PCR實(shí)驗(yàn),余下的-70度保存。2.3RT-PCR的引物設(shè)計(jì)
RT-PCR引物設(shè)計(jì)和一般PCR引物設(shè)計(jì)可以遵循同樣的原則。細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計(jì)是PCR中zui重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計(jì)糟糕的引物可能會同擴(kuò)增其他的非目的序列。設(shè)計(jì)理想的引物都有以下共同的特點(diǎn),而設(shè)計(jì)失敗的引物則各有各的缺點(diǎn):
*典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長,保證序列*性,并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交,降低了特異性,而且比短序列雜交慢,從而降低了產(chǎn)量。
*選擇GC含量為40%到60%或GC含量反映模板GC含量的引物。
*設(shè)計(jì)5'端和中間區(qū)為G或C的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。
*避免引物對3'末端存在互補(bǔ)序列,這會形成引物二聚體,抑制擴(kuò)增。
*避免3'末端富含GC。設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在zui后5個核苷中含有3個A或T。
*避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
*避免存在可能會產(chǎn)生內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的序列,這會破壞引物退火穩(wěn)定性。
目的序列上并不存在的附加序列,如限制位點(diǎn)和啟動子序列,可以加入到引物5'端而不影響特異性。當(dāng)計(jì)算引物Tm值時(shí)并不包括這些序列,但是應(yīng)該對其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的檢測。
引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個月,但在室溫(15℃到30℃)僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年,在室溫(15℃到30℃)zui多可以保存2個月。
2.4引物退火溫度
引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度(Tm)。這是當(dāng)50%的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度。Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下,退火溫度足夠低,以保證引物同目的序列有效退火,同時(shí)還要足夠高,以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃。
根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同,Tm會差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋€估算的Tm值,所有退火溫度只是一個起始點(diǎn)??梢酝ㄟ^分析幾個逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃,以2℃為增量,逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得*結(jié)果,兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃,就會由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同,將退火溫度設(shè)定為比zui低的Tm低5℃?;蛘邽榱颂岣咛禺愋裕梢栽诟鶕?jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個循環(huán),然后再根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
2.5提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度
較高的保溫溫度有助于RNA二級結(jié)構(gòu)的打開,增加了反應(yīng)的產(chǎn)量。對于多數(shù)RNA模板,在沒有緩沖液或鹽的條件下,將RNA和引物在65℃保溫,然后迅速置于冰上冷卻,可以消除大多數(shù)二級結(jié)構(gòu),從而使引物可以結(jié)合。然而某些模板仍然會存在二級結(jié)構(gòu),即使熱變性后也是如此。較高的保溫溫度也可以增加特異性,尤其是當(dāng)使用基因特異性引物(GSP)進(jìn)行cDNA合成時(shí)。如果使用GSP,確保引物的Tm值與預(yù)計(jì)的保溫溫度相同。不要在高于60℃時(shí)使用oligo(dT)和隨機(jī)引物。隨機(jī)引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鐘。除了使用較高的逆轉(zhuǎn)錄溫度外,還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉(zhuǎn)到逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度,并加入預(yù)熱的2×的反應(yīng)混合物提高特異性(cDNA熱啟動合成)。這種方法有助于防止較低溫度時(shí)所發(fā)生的分子間堿基配對。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度切換。
2.6促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄的添加劑
包括甘油和DMSO在內(nèi)的添加劑加到*鏈合成反應(yīng)中,可以減低核酸雙鏈的穩(wěn)定并解開RNA二級結(jié)構(gòu),zui多可以加入20%的甘油或10%的DMSO而不影響或MMLV的活性。AMV也可以耐受zui多20%的甘油而不降低活性。為了在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中zui大限度提高RT-PCR的靈敏度,可以加入10%的甘油并在45℃保溫。如果1/10的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物加入到PCR中,那甘油在擴(kuò)增反應(yīng)中的濃度為0.4%,這不足以抑制PCR。
在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。RNase抑制劑要在*鏈合成反應(yīng)中,在緩沖液和還原劑(如DTT)存在的條件下加入,因?yàn)閏DNA合成前的過程會使抑制劑變性,從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNaseA,B,C對RNA的降解,并不能防止皮膚上的RNase,因此盡管使用了這些抑制劑,也要小心不要從手指上引入RNase。
使用無RNaseH活性(RNaseH-)的逆轉(zhuǎn)錄酶:逆轉(zhuǎn)錄酶催化RNA轉(zhuǎn)化成cDNA,不管是M-MLV還是AMV,在本身的聚合酶活性之外,都具有內(nèi)源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈,并降解RNA:DNA復(fù)合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物,降低了cDNA合成的產(chǎn)量和長度。因此消除或大大降低逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。RNaseH-的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及RNaseH-的AMV,比MMLV和AMV能得到更多量和更多全長。RT-PCR靈敏度會受cDNA合成量的影響。RT-PCR產(chǎn)物的大小受限于逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的能力,尤其是克隆較大的cDNA時(shí)。RNaseH-的逆轉(zhuǎn)錄酶可以顯著提高長RT-PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量,同時(shí)增加了熱穩(wěn)定性,所以反應(yīng)可以在高于正常的37-42℃的溫度下進(jìn)行。
2.7RNaseH處理
在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應(yīng)可以提高靈敏度。對于某些模板,據(jù)認(rèn)為cDNA合成反應(yīng)中的RNA會阻止擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合,在這種情況下,RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當(dāng)擴(kuò)增較長的全長cDNA目標(biāo)模板時(shí),RNaseH處理是必需的,比如低拷貝的。對這種困難模板,RNaseH的處理加強(qiáng)了或AMV合成的cDNA所產(chǎn)生的信號。對于多數(shù)RT-PCR反應(yīng),RNaseH處理是可選的,因?yàn)?5℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA:DNA復(fù)合物中的RNA水解掉。2.8小量RNA檢測方法的提高
當(dāng)僅有小量RNA時(shí),RT-PCR尤其具有挑戰(zhàn)性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產(chǎn)量??梢栽诩尤隩rizol的同時(shí)加入無RNase的糖元。糖元是水溶性的,可以同RNA保持在水相中以輔助隨后的沉淀。對于小于50mg的組織或106個培養(yǎng)細(xì)胞的樣品,無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。
2.9一步法同兩步法RT-PCR的比較
兩步法RT-PCR比較常見,在使用一個樣品檢測多個mRNA時(shí)比較有用。然而一步法RT-PCR具有其他優(yōu)點(diǎn)。一步法RT-PCR在處理大量樣品時(shí)易于操作,有助于減少殘余污染,因?yàn)樵赾DNA合成和擴(kuò)增之間不需要打開管蓋。一步法可以得到更高的靈敏度,zui低可以達(dá)到0.1pg總RNA,這是因?yàn)檎麄€cDNA樣品都被擴(kuò)增。對于成功的一步法RT-PCR,一般使用反義的基因特異性引物起始cDNA合成。
2.10增加RT-PCR特異性
*鏈cDNA合成的起始可以使用三種不同的方法,各種方法的相對特異性影響了所合成cDNA的量和種類。
隨機(jī)引物法是三種方法中特異性zui低的。引物在整個轉(zhuǎn)錄本的多個位點(diǎn)退火,產(chǎn)生短的,部分長度的cDNA。這種方法經(jīng)常用于獲取5'末端序列及從帶有二級結(jié)構(gòu)區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn)錄酶不能復(fù)制的終止位點(diǎn)的RNA模板獲得cDNA。為了獲得zui長的cDNA,需要按經(jīng)驗(yàn)確定每個RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機(jī)引物的起始濃度范圍為50到250ng每20μl反應(yīng)體系。因?yàn)槭褂秒S機(jī)引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA,所以模板一般選用poly(A)+RNA。
Oligo(dT)起始比隨機(jī)引物特異性高。它同大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA3'端所發(fā)現(xiàn)的poly(A)尾雜交。因?yàn)閜oly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2%,所以與使用隨機(jī)引物相比,cDNA的數(shù)量和復(fù)雜度要少得多。因?yàn)槠漭^高的特異性,oligo(dT)一般不需要對RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進(jìn)行優(yōu)化。建議每20μl反應(yīng)體系使用0.5μgoligo(dT)。oligo(dT)12-18適用于多數(shù)RT-PCR。ThermoScriptRT-PCRSystem提供了oligo(dT)20,因?yàn)槠錈岱€(wěn)定性較好,適用于較高的保溫溫度。
基因特異性引物(GSP)對于逆轉(zhuǎn)錄步驟是特異性的引物。GSP是反義寡聚核苷,可以特異性地同RNA目的序列雜交,而不象隨機(jī)引物或oligo(dT)那樣同所有RNA退火。用于設(shè)計(jì)PCR引物的規(guī)則同樣適用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)GSP的設(shè)計(jì)。GSP可以同與mRNA3'zui末端退火的擴(kuò)增引物序列相同,或GSP可以設(shè)計(jì)為與反向擴(kuò)增引物的下游退火。對于部分?jǐn)U增對象,為了成功進(jìn)行RT-PCR,需要設(shè)計(jì)多于一個反義引物,因?yàn)槟康腞NA的二級結(jié)構(gòu)可能會阻止引物結(jié)合。建議在20μl的*鏈合成反應(yīng)體系中使用1pmol反義GSP。
2.11提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度
為了充分利用GSP特異性的全部優(yōu)點(diǎn),應(yīng)該使用有較高熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶。熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶可以在較高溫度保溫以增加反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)性。比如,如果一個GSP退火溫度為55℃,那么如果使用AMV或M-MLV在低嚴(yán)謹(jǐn)性的37℃進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,GSP所帶有的特異性就沒有*利用。然而某些特別的逆轉(zhuǎn)錄酶可以在50℃或更高進(jìn)行反應(yīng),這就會消除較低溫度時(shí)產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物。為獲得zui大的特異性,可以將RNA/引物混合物直接從65℃變性溫度轉(zhuǎn)移到逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度。這有助于防止低溫時(shí)分子間堿基配對。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度轉(zhuǎn)換。
2.12減少基因組DNA污染
RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中沾染的基因組DNA。使用較好的RNA分離方法,如Trizol,會減少RNA制備物中沾染的基因組DNA。為了避免產(chǎn)生于基因組DNA的產(chǎn)物,可以在逆轉(zhuǎn)錄之前使用擴(kuò)增級的DNaseⅠ對RNA進(jìn)行處理以除去沾染的DNA。將樣品在2.0mMEDTA中65℃保溫10分鐘以終止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合鎂離子,防止高溫時(shí)所發(fā)生的依賴于鎂離子的RNA水解。
為了將擴(kuò)增的cDNA同沾染的基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物分開,可以設(shè)計(jì)分別同分開的外顯子退火的引物。來源于cDNA的PCR產(chǎn)物會比來源于沾染的基因組DNA的產(chǎn)物短。另外對每個RNA模板進(jìn)行一個無逆轉(zhuǎn)錄的對照實(shí)驗(yàn),以確定一個給定片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉(zhuǎn)錄時(shí)所得到的PCR產(chǎn)物來源于基因組。