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    實(shí)驗(yàn)室日常小技巧集錦

    發(fā)布時(shí)間: 2010-04-28  點(diǎn)擊次數(shù): 2451次

    平時(shí)在實(shí)驗(yàn)室zui常聽到的一句話就是今天某某試驗(yàn)沒(méi)做好是為什么?今天某某試驗(yàn)沒(méi)出結(jié)果是什么原因?今天某某試驗(yàn)為什么會(huì)是這樣的呢?等等。然后仔細(xì)一查找原因,往往是由于操作上面的不認(rèn)真,或是一些小小的細(xì)節(jié)沒(méi)有注意到。以下是集各路朋友的一些經(jīng)驗(yàn),與大家分享:
    1
    page膠的時(shí)候,小電壓跑會(huì)避免高電壓產(chǎn)生的熱量爾導(dǎo)致的膠層變形。低電壓泳道會(huì)比大電壓泳道跑的直一些,且分離效果更高,有利于分子量相差不大的蛋白分離。
    2.
    提取質(zhì)粒的時(shí)候,zui后一步的酒精揮發(fā)很關(guān)鍵,基本上是其后續(xù)的酶切反應(yīng)的決定性因素。所以這一步盡量揮發(fā)長(zhǎng)一點(diǎn)時(shí)間,是空調(diào)吹熱風(fēng),或是37度溫箱放長(zhǎng)一點(diǎn)的時(shí)間,我試過(guò)室溫過(guò)夜,酶切很好。
    3.
    WESTERN BLOT 的時(shí)候,大家往往會(huì)摸索一抗、二抗的濃度,封閉時(shí)間,曝光時(shí)間等等,而每次變換其中的一個(gè)條件就需要從新跑膠、轉(zhuǎn)膜,甚至重新提蛋白,這樣會(huì)浪費(fèi)大量的時(shí)間。其實(shí)*沒(méi)有必要這樣。一次轉(zhuǎn)膜后,將PVDF膜晾干,裁減成小塊,保存起來(lái),用的時(shí)候取出一塊,沒(méi)有任何影響。這對(duì)于摸索條件的戰(zhàn)友來(lái)說(shuō),節(jié)約了大量的時(shí)間。
    4.
    有關(guān)緩沖液和培養(yǎng)基配置
    1
    )將緩沖液配方中的成分分別以10100倍配成母液儲(chǔ)存,需要的時(shí)候只需將相應(yīng)的母液混合,補(bǔ)加水稀釋即可
    2
    )配培養(yǎng)基時(shí)通常會(huì)忘記各成分的量,如配LB時(shí)的三個(gè)成分不記得到底哪個(gè)是5g,哪個(gè)要10個(gè),因此可以在常用的試劑瓶的標(biāo)簽上注明所需的量,如配LB時(shí),在NaCl瓶外注明10g/L, yeast 5 g/L, tryton 10 g/L等,很方便,不需要每次配之前臨時(shí)翻書
    5.
    有關(guān)PCR主反應(yīng)液配置:

    在做克隆鑒定的時(shí)候經(jīng)常需要在酶切鑒定前進(jìn)行PCR鑒定,每次配置PCR反應(yīng)液很繁瑣,可以將其配置類似kit的形式,按你需要的反應(yīng)體系列表,然后放大100倍配置100×主反應(yīng)液(100次反應(yīng)),其中含buffer,Mg2+,dNTPs,但不含引物和Taq酶,然后可以10×分裝或一管儲(chǔ)存在-20度,在需要的時(shí)候拿出融開,然后按所需的PCR反應(yīng)個(gè)數(shù)吸取相應(yīng)的倍數(shù),再補(bǔ)加相應(yīng)反應(yīng)倍數(shù)的Taq和引物,混勻后分裝,這樣做的好處如下:

    1
    )可很大的節(jié)省寶貴的時(shí)間,可早點(diǎn)收工,看球
    2
    )避免每次反應(yīng)加樣不均的可能
    3
    )大大減少PCR假陽(yáng)性的產(chǎn)生
    6.
    有關(guān)酶切反應(yīng)液的配置:

    在做酶切時(shí),也可以象PCR一樣配置主反應(yīng)液,每次反應(yīng)前先列好反應(yīng)的體系,算好需要的反應(yīng)數(shù),然后按所需反應(yīng)的體系按所需反應(yīng)數(shù)放大,加入buffer、酶、水,質(zhì)粒欄空缺,然后混合后按除質(zhì)粒DNA的體積分裝,然后再在每管中加入相應(yīng)體積的質(zhì)粒DNA酶切,這樣做的好處如下,特別是當(dāng)同時(shí)有10幾個(gè)陽(yáng)性克隆需要鑒定時(shí)尤為明顯:

    1
    )各反應(yīng)成分均一
    2
    )可大大減少限制型內(nèi)切酶的使用
    3
    )節(jié)省時(shí)間
    7.
    有關(guān)SDSPAGE

    1
    )可將SDSPAGE的積層膠,分離膠預(yù)先配好大體積如100ml儲(chǔ)存在4度冰箱(注:10AP,TEMED不加,切記!?。。?,每次配置時(shí)只需吸取相應(yīng)體積的預(yù)制膠加入AP,TEMED即可,沒(méi)必要每次制膠時(shí)候翻分子克隆,特別方便,而且,這樣的預(yù)制膠可儲(chǔ)存半年以上,不失為偷懶的方法;更關(guān)鍵的是可大大減少與丙稀酰胺的接觸,因此大大減少中毒的機(jī)會(huì)。

    2
    )電泳時(shí)雖然小電泳分離效果要好一些,但2小時(shí)以上的等待的時(shí)間實(shí)在是痛苦,因此可以提高電泳至150V,但需要將整個(gè)電泳槽放在放滿冰水的臉盆里散熱,這樣跑出來(lái)的膠分離效果絲毫不比低電壓來(lái)的差,關(guān)鍵是時(shí)間大大節(jié)省,不需1h即可看結(jié)果了
    8.
    實(shí)驗(yàn)中小竅門我想能夠分成兩類:一類是非常規(guī)操作;一類是常規(guī)操作過(guò)程中一些省時(shí)省事手段。
    前一類,我舉個(gè)例子:有時(shí)候*天涂的轉(zhuǎn)化平板、次日早晨轉(zhuǎn)化子可能長(zhǎng)成的菌落比較大(1~2毫米以上,BL21就長(zhǎng)得快),下一步轉(zhuǎn)化子做質(zhì)粒鑒定。這個(gè)情況下可以直接挑取一塊菌苔(勿帶出培養(yǎng)基),50微升酚/氯仿懸浮菌體,放置兩分鐘,加40微升TE抽提,上層TE吸出后再氯仿抽提一次,吸取上層TE即是質(zhì)粒提取液。提取的質(zhì)??梢灾苯佑糜陔娪竞兔盖?。這樣操作,可以省去轉(zhuǎn)接液體試管的培養(yǎng)步驟,至少節(jié)省6~8小時(shí)的時(shí)間。但是,要在各步驟都控制得很好的情況下才能保證提取和酶切的效果,不同的實(shí)驗(yàn)室或者操作者未必能夠很方便地重復(fù)----其實(shí),其它的一些小竅門也是如此。
    后一類的小竅門則在實(shí)驗(yàn)室中無(wú)處不在。如:平行作不同樣本的PCR,模板DNA加量一樣,配置PCR體系可以一起配制后分裝----這點(diǎn)做過(guò)試驗(yàn)的都知道,但是配制的時(shí)候配制量可以比預(yù)期分裝量稍多一點(diǎn)(如用100微升則配110微升),這樣可以避免有時(shí)候分裝不夠的尷尬,因?yàn)椴煌貏e是大小不同的槍,會(huì)有誤差。再比如:樓上有站友說(shuō)的sds-page膠預(yù)配(APSTEMED、或者后者先不加)的問(wèn)題,實(shí)際上時(shí)間放置過(guò)長(zhǎng)肯定影響效果,如果要在一天內(nèi)連續(xù)地跑兩次板,何嘗不可?又比如,配sds-page膠的時(shí)候,上層膠和下層膠可以只用一個(gè)大槍頭:先取膠,次取水,取6.8tris后再取8.8tris,省時(shí)省料。
    20021108
    站友開的這個(gè)帖子很好,在上上層樓的帖子說(shuō)得也有道理。但我想,竅門偷懶不應(yīng)該是因果關(guān)系。其實(shí),不管是那一類的小竅門,都是在充分地理解實(shí)驗(yàn)各步驟的原理、經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)積累、再加上一點(diǎn)點(diǎn)思索然后嘗試的結(jié)果。知其然知其所以然和勤于思考敢于探索,是根本。否則,別人的小竅門對(duì)你也未必能夠有用。才進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的新手,務(wù)必要先練好規(guī)范扎實(shí)的操作,然后才能弄竅門。本末倒置,貽害無(wú)窮。
    9.
    我一直是把SDSPAGE的積層膠,分離膠預(yù)先配成mixture,APS制膠時(shí)加入,半年內(nèi)使用,沒(méi)有問(wèn)題,我保證。
    10.
    SDS-PAGE的時(shí)候,除了蛋白量上樣一致,體積也一致,這樣跑出來(lái)的膠各個(gè)泳道之間的band能做到一樣寬,方便后面的比較,特別是WB。做法就是拿1X的上樣緩沖補(bǔ)全要加的樣做到體積一致,否則跑出來(lái)會(huì)有的寬有的窄,特別是上樣體積相差較大的。
    11.
    在把蛋白膠做成干膠時(shí),很多時(shí)候會(huì)因?yàn)橛袣馀菔鼓z裂掉,我的經(jīng)驗(yàn)是在做膠時(shí)加上層膜前在膠上多加些水就不容易進(jìn)氣泡了,還有就是高溫烘膠,我喜歡放到60度烘箱里烘,這樣水分蒸發(fā)速度快,即使有一些小的氣泡也不會(huì)有影響,呵呵,這是經(jīng)驗(yàn)之談,我從來(lái)都沒(méi)失手過(guò),大家可以試試
    12.
    做大腸表達(dá)時(shí)確定蛋白是否表達(dá)一般要煮樣做誘前誘后檢測(cè),但很多時(shí)候煮出來(lái)的很黏影響跑膠效果.我發(fā)現(xiàn)如果現(xiàn)用8M Urea重懸細(xì)菌再煮效果會(huì)有很大改善.
    :不能用Gu-HCl代替
    13.
    我也推薦幾個(gè)偷懶的方法
    1
    SDS-PAGE跑膠通常都是現(xiàn)配現(xiàn)用,但配膠要>1h,所以如果想第二天睡個(gè)懶覺(jué)而又不耽誤跑膠可以于前一天晚上做好濃縮膠和分離膠,待凝聚后不要拔下梳子,把含膠玻璃板從制膠槽取下,用保鮮膜包上,注意玻璃板上下兩邊緣會(huì)有氣體,所以需要加一點(diǎn)電泳緩沖液以避免膠內(nèi)水分蒸發(fā).然后放4度過(guò)夜.第二天直接拔下梳子行后續(xù).國(guó)外好多公司出售腳既是如此,可以保存上星期.

    2
    配置分離膠或者非變性膠時(shí)因膠凝時(shí)收縮可導(dǎo)致加樣孔變淺.可以將加剩的膠放入4度以降低凝聚速度,而將凝膠放入37度促聚,并隨時(shí)用4度加剩的膠補(bǔ)充下降的膠面.另外將膠橫放與水平面成~10度角也可以減少收縮的影響.

    3
    推薦一個(gè)節(jié)約抗體/時(shí)間的做法:
    同時(shí)跑2塊膠,同時(shí)轉(zhuǎn)膜,然后兩塊膜背靠背放入同一封口膜同時(shí)封閉,同時(shí)一抗二抗是用轉(zhuǎn)輪,這樣效果好.如果是搖床,隔一段時(shí)間幫它們翻個(gè)身以保證兩張膜的正面都有機(jī)會(huì)與液體充分接觸.一起洗膜可以稍微加強(qiáng)洗膜也可以不做.我zui多一張盤子里放4張膜而沒(méi)有影響洗膜).可分別或同時(shí)壓片.這樣就可以節(jié)約一半抗體和接近一半時(shí)間而不會(huì)影響結(jié)果.
    或者另外一個(gè)就是孵育后的抗體不要扔,好的抗體可以反復(fù)做好幾張膜呢.但每次都會(huì)減弱,效果不如上面一種方法.
    14.
    western blotting 轉(zhuǎn)膜時(shí),膠放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中一段時(shí)間,待膠在含有甲醇的緩沖夜中縮小的差不多后裝好轉(zhuǎn)膜裝置,我的經(jīng)驗(yàn)是把膜印在膠上直接在膜上畫出預(yù)染maker條帶,方便的很。因?yàn)楹芏鄷r(shí)候跑電泳時(shí)膠上的預(yù)染maker很清楚,等轉(zhuǎn)膜后就不是分辨的很清楚了。不過(guò)要注意畫好預(yù)染maker后就不要使膠和膜發(fā)生對(duì)位移動(dòng)了,以防maker失去參照價(jià)值。
    15.
    超濾zui合適用于蛋白的濃縮,更換緩沖液和除鹽,對(duì)于按照分子量進(jìn)行初分離的效果不是很好,理論和現(xiàn)實(shí)是有很大差別的^_^
    16.
    關(guān)于Western Blot
    1
    )器具的清潔非常重要,開始做前,為了安全,尤其是裝膠的厚薄玻璃板,可以先用中性洗滌劑和自來(lái)水反復(fù)沖洗,確保無(wú)洗滌殘液后用蒸餾水沖洗23遍,然后用去離子水沖洗一遍。zui后用95%酒精再擦一遍后晾干備用。
    2
    )配膠現(xiàn)用現(xiàn)配,先配下層膠(分離膠),后配上層膠(濃縮膠或積層膠),而且在臨灌膠前加APS并迅速混勻,即用移液槍抽吸與注入12次即可。
    17
    跑蛋白page的時(shí)候,一開始用加樣針,太麻煩,發(fā)現(xiàn)用20ul+普通小白槍頭點(diǎn),非常省事。另外,點(diǎn)樣時(shí)有可能看不清孔在哪,看遠(yuǎn)離你的那面膠,孔有反光的。點(diǎn)樣也點(diǎn)你對(duì)面的那塊膠,省的總低頭,干咱這行的容易得頸椎呀,愛(ài)惜自己。
    18.
    垂直電泳時(shí),可在電泳糟中放入青霉素小瓶等,可自然使液面提高而不影響電泳,又很節(jié)約電泳緩沖液。
    19.
    我們有時(shí)要沉淀東西時(shí),由于沉淀量很少,離心完之后不知道到底有沒(méi)沉淀下來(lái)東西,由于量很少,不好觀察,所以離心時(shí)建議按特定的方向放置離心管,這樣你就可以在離心之前確定沉淀該沉淀到管子的大致部位,這樣離心后就可直接觀察那有沒(méi)有沉淀,避免滿管子找,另外看沉淀時(shí)可以對(duì)光看,這樣就是顆粒狀的細(xì)小沉淀也能看見的。
    20.
    大家都知道PMSF有劇毒,以前都是知道濃度和要配的體積的基礎(chǔ)上,算出要稱多少毫克的PMSF,其實(shí)也可以先稱PMSF,稱多少算多少,再調(diào)整異丙醇的體積,到達(dá)你所要的濃度。這樣就避免了你長(zhǎng)時(shí)間和它接觸。
    21.
    跑好SDS-PAGE膠的一些體會(huì)。
    1.
    清洗好玻璃板,不要偷懶,很多時(shí)候跑完電泳撬膠時(shí)會(huì)因?yàn)椴AО宀桓蓛裟z粘在板上把膠撬破。
    2.
    配膠時(shí)不要反復(fù)用槍混,稍微搖混就可以了,用槍混多次會(huì)導(dǎo)致膠凝不好影響電泳圖的分辨率。
    3. AP
    分裝成500微升一管保存放-20度,避免AP用太久失效。
    4.
    倒膠時(shí)把玻璃板中的水用濾紙盡量吸干,因?yàn)槲⒘康乃嬖跁?huì)影響配的膠濃度。
    5.
    盡量不用過(guò)夜放室溫或者四度的膠,也回影響膠 的分離效果。
    6.
    電泳完撬膠時(shí)根本不需要用撬膠板,在一平皿里裝好水,把有膠一面的放在水中晃動(dòng)幾次膠很容易就脫落下來(lái),一點(diǎn)沒(méi)有問(wèn)題,方便的很。
    7.
    點(diǎn)樣時(shí)樣品別忘了離心這步,因?yàn)樯蠘雍泄腆w沉淀會(huì)影響電泳圖分辨效果。
    8.
    盡量在冰浴狀態(tài)下跑。
    22.
    做?。玻模拧∽龅谋容^多,總結(jié)了幾個(gè)小竅門:

    1.一向電泳時(shí),鹽離子容易聚在 膠槽的兩側(cè).剪一小段IPG膠條放在  兩側(cè),構(gòu)成鹽橋,電壓就容易上去了.避免一向電泳不好影響zui后實(shí)驗(yàn)  結(jié)果.

    2. SDSPAGE時(shí),在灌膠之前,一般大家都會(huì)用凡士林封底, SDSPAGE
    電 泳之前又必須把凡士林搽干凈,很是麻煩,我的經(jīng)驗(yàn)是:不用凡士林,取少量未加Ap的分離膠,按比例加2倍量的Ap,然后灌入板間,等上幾分鐘,待膠凝固后就可以接著灌分離膠了.方面,效果好!
    23.
    蛋白質(zhì)純化時(shí),蛋白質(zhì)降解可能與超聲破菌保持冰浴有關(guān),之前建議加pmsf,建議在上柱子洗脫的時(shí)候也加pmsf(蛋白降解抑制劑),一定要用之前再加。
    24.
    做透析的時(shí)候,拿一個(gè)5ml的槍頭或者是其他類似的東西,剪短,穿過(guò)個(gè)塑料泡沫之類的面積比燒杯大東西,然后把透析帶一端扎緊,另一端開口綁緊在5ml槍頭下端,扎緊得那端也可以彎過(guò)來(lái)綁成u字型。這樣就可以用1ml的槍穿過(guò)5ml的槍頭的孔,另一只手調(diào)整透析帶,來(lái)加樣取樣,省去了總綁透析帶的麻煩,對(duì)同一個(gè)蛋白大量多次透析非常方便
    25.
    *次發(fā)貼說(shuō)一下自己的小經(jīng)驗(yàn),希望版主能給我一分,每次看到好東西因?yàn)闆](méi)分都沒(méi)法下,好羨慕有分的人啊。當(dāng)然也不能不勞而獲,說(shuō)一下自己的實(shí)驗(yàn)技巧給大家分享。
    1.
    SDS-PAGE膠時(shí),用槍頭混勻比較麻煩,而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力,效果也不好。可以剪一小段夾文件的那種曲針做轉(zhuǎn)子放到配膠的小燒杯里,在磁力攪拌器上邊攪邊加入各溶液,這樣加完也就混勻了,直接灌膠即可。
    2.
    上面的站友也說(shuō)過(guò),上樣用黃槍頭就行,我也一直在用,根本不用注射器,方便的很,建議大家也試試。
    3.
    電泳后考馬斯亮藍(lán)染色一般要1h2h,脫色也要2h左右,麻煩的很。現(xiàn)在給大家說(shuō)一個(gè)簡(jiǎn)單的方法,是我從一個(gè)師姐那里學(xué)到的。

    加入染色液后,先放入微波爐里加熱5-10秒,使染色液微熱即可(千萬(wàn)不要加熱太久,否則冰醋酸就揮發(fā)了)。然后放水平搖床上搖20分鐘,zui多半小時(shí)就染好了。
    脫色也很簡(jiǎn)單,不用脫色液,直接用去離子水,放微波爐里煮沸5分鐘左右,然后將水倒掉,再換上新的去離子水煮,這樣反復(fù)幾次,就可以了。效果可能比正常的脫色稍差一點(diǎn)點(diǎn),不如那樣清楚,只要電泳時(shí)比平時(shí)多上1/5的樣品就可以了,關(guān)鍵是這樣省時(shí)省材料(用不著含甲醇和冰醋酸的脫色液)。方便快捷!
    放心,反復(fù)煮膠不會(huì)把膠煮壞的。
    26.
    我也說(shuō)說(shuō)我的小經(jīng)驗(yàn)??赡艽蠹叶贾溃?qǐng)別笑話我。
    1
    、配膠時(shí)一定要掌握好時(shí)間,不要因?yàn)檫^(guò)度趕時(shí)間,而造成以后的條帶粗大,壓不成條帶,且消耗很多試劑和時(shí)間。
    2
    、加樣時(shí),沖洗加樣器可用雙蒸水,用電泳液會(huì)使加樣器中有很多的泡沫。或許是因?yàn)?span lang="EN-US">SDS
    的原因吧?
    3
    、對(duì)于大分子蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)膜過(guò)夜更好。濾紙的張數(shù)可以適當(dāng)減少。
    4
    、在跑樣時(shí)同時(shí)加入MARKER有助于正確識(shí)別所需的蛋白位置,減少NC膜的消耗。
    5
    、一抗、二抗的濃度不要太高。
    6
    、做ECL顯影時(shí),根據(jù)熒光的亮度調(diào)整時(shí)間。泡完顯影液,膠片應(yīng)用水洗一下,以減少定影液變黃。
    7
    、和有經(jīng)驗(yàn)的同學(xué)交流,也是非常重要的。知識(shí)的交流有助于試驗(yàn)的成功。
    這是我目前的一點(diǎn)拙見。
    27.
    推薦一個(gè)省質(zhì)粒試劑盒硅膠柱與溶液的方法:
    所有試劑使用手提質(zhì)粒自己配置的溶液一、溶液二、溶液三(代替試劑盒的solution1、23),然后一比一的與飽和碘化鉀或碘化鈉(代替結(jié)合緩沖液)混合,就可以讓質(zhì)粒在硅膠上結(jié)合,而試劑盒的硅膠柱可以重復(fù)使用,沒(méi)有試劑盒溶液量的限制,只要是一樣的質(zhì)粒我想提幾管就提多少。
    順便說(shuō)一句硅膠柱也可以用自己買的硅膠粉末代替,離心后倒掉硅膠柱上面的上清就可以,用起來(lái)不象柱子方便。效果比手提的要好要快。
    28.
    WB時(shí),樣品比較多, 又怕放時(shí)間長(zhǎng)了對(duì)蛋白樣品不好,而且確定以后肯定要做某個(gè)抗體,只是一時(shí)沒(méi)有決定.那么你可以選擇先做SDS-PAGE,并轉(zhuǎn)膜. 然后把PVDF膜涼干, 放四度保存. 以后拿出來(lái)封閉后,加抗體就行了. 蛋白在膜上,且已經(jīng)分離, 比保存在BUFFER里面的蛋白肯定更可靠。呵呵
    29.
    今天作his純化的時(shí)候,又琢磨了一個(gè)竅門,與大家分享。我得樣品比較多,幾百ml,而柱子不夠大,只有10ml,跑來(lái)跑去的上樣,還總得記著,太麻煩了。于是,我就刷干凈了一個(gè)燒杯,裝了我的樣品,找了一個(gè)細(xì)膠皮管,當(dāng)連通器,就像魚缸換水一樣,用5ml槍在一頭一吸,液體流出來(lái),放到純化柱里,調(diào)好燒杯的位置,兩個(gè)液面一樣平了,呵呵,上了好幾個(gè)小時(shí)了,沒(méi)有問(wèn)題,現(xiàn)在調(diào)低速度,過(guò)夜上樣:)
    30.
    能導(dǎo)致PAGE膠不凝的原因主要有三個(gè):
    1
    、配膠中用到的主要試劑的配置。
    主要就是30%的丙稀酰胺的配置。 粉末狀的丙稀酰胺和甲叉丙稀酰胺使用不應(yīng)該超過(guò)一年,因?yàn)楸□0窌?huì)吸潮水解,這樣以來(lái)丙烯酸的含量就會(huì)加大,從而導(dǎo)致page膠不凝。
    2
    、溫度。
    溫度高時(shí)凝固快,但是亦不宜過(guò)高,因?yàn)闇囟茸兓瘯?huì)影響交連物的孔徑大小。所以溫度在25度zui為合適。
    3
    、氧氣。
    氧氣是凝固的終止劑,所以不能讓膠中出現(xiàn)氣泡。
    雖然都是些看起來(lái)聽低級(jí)的錯(cuò)誤,但是不注意還是會(huì)犯。
    31.
    我做2維蛋白電泳,也有些心得:
    1
    、向電泳玻璃板內(nèi)加入膠條時(shí),先在縫隙中加入配好的溴芬蘭緩沖液,要加滿,再將膠條貼后面玻璃板壁用薄塑料片將膠條緩緩?fù)葡轮聊z上緣,這樣可以很好的避免膠條下形成空氣泡。
    2
    、 能做出好的圖譜已經(jīng)很不容易了,如果在掃圖時(shí)撕破實(shí)在可惜,所以掃圖要小心,將凝膠轉(zhuǎn)移到掃描儀時(shí)可以用塑料隔片在下面托著,同時(shí)保持有些水,這樣就安全多了。
    32.
    湊個(gè)熱鬧說(shuō)兩句吧

    1
    sds-page膠如果配好裝好倒入內(nèi)槽液以后,發(fā)現(xiàn)內(nèi)槽液稍有滲漏,可以把外槽液多加一些,加滿,加到與內(nèi)槽液相齊,這樣就可以繼續(xù)正常跑膠,不用浪費(fèi)已經(jīng)加進(jìn)去的內(nèi)槽液

    2
    、至于染色脫色的問(wèn)題,我們這里一直是染色:加熱半分鐘,搖20分鐘;如果染液不是新配的,就加熱半分鐘搖十分鐘,涼透了再重復(fù)一次即可
    脫色也一直是用去離子水煮兩三次即可

    3
    、不知道大家都是怎么做酶切的,我的體會(huì)是,酶切質(zhì)粒時(shí),兩個(gè)酶分別單酶切比直接雙酶切效果要好很多。我有一次雙酶切兩次都沒(méi)連出來(lái),后來(lái)分步單酶切,連接效率幾乎100%。
    可以*個(gè)酶切完后直接把體系熱失活,(根據(jù)酶說(shuō)明書上一般是6520min)然后直接向里面補(bǔ)第二個(gè)酶
    或者*個(gè)切完后用氯仿抽提,把蛋白提出
    或者中間做一次回收,這個(gè)就要考慮回收效率和損失的問(wèn)題了,但是這樣除蛋白zui*
    前兩個(gè)方法我們這都是有人做過(guò)的,已經(jīng)都很好用了
    33.
    俺也來(lái)說(shuō)說(shuō)關(guān)于Bradford法蛋白濃度定量和DTNB法巰基濃度定量的一點(diǎn)體會(huì):
    我是做蛋白修飾巰基后,通過(guò)這兩種方法的定量來(lái)間接反應(yīng)修飾的程度。一路摸索過(guò)來(lái),也有半年有余;zui大的體會(huì)就是不要急于求成,直接實(shí)驗(yàn),首先檢測(cè)修飾體系是否對(duì)方法有影響,修飾基團(tuán)是否會(huì)在595nm412nm下有特定的吸收,修飾后修飾試劑本身是否會(huì)有變化,對(duì)蛋白整體結(jié)構(gòu)造成影響,其次再談具體修飾比例和程度。對(duì)于巰基濃度測(cè)定方法,有四種(Anal Biochem. 1998 Dec 1;265(1):8-14),而DTNB本身雖然靈敏度不高,但是重復(fù)性和抗干擾是*的了。
    34.
    考馬斯亮藍(lán)染色后的脫色,如在脫色液中加數(shù)張捏成條狀的Kimwipes紙(國(guó)外實(shí)驗(yàn)室常用,相當(dāng)我們的擦鏡紙,全棉纖維制造),由于染料吸附到紙纖維上,脫色加速。待紙著色較深時(shí),更換新紙條,不用換液。我想脫脂棉或紗布也是一樣的。但濾紙等可能不行,會(huì)溶掉。

    半貼壁細(xì)胞如SP/0或雜交瘤細(xì)胞傳代時(shí),不用吹打或刮落。先將上清吸出,適當(dāng)拍打培養(yǎng)瓶(當(dāng)然是塑料瓶,玻璃瓶拍碎了別找我),即可見貼壁細(xì)胞脫落,加培養(yǎng)基混懸即可。注意,過(guò)力拍打培養(yǎng)瓶會(huì)裂,特別是瓶頸。
    35.
    一向電泳時(shí),鹽離子容易聚在 膠槽的兩側(cè).剪一小段IPG膠條放在  兩側(cè),構(gòu)成鹽橋,電壓就容易上去了.避免一向電泳不好影響zui后實(shí)驗(yàn)  結(jié)果.
    36.
    我也推薦幾條:
    1
    、關(guān)于20021108戰(zhàn)友的說(shuō)法,我覺(jué)得我們制備好了一批感受態(tài),馬上轉(zhuǎn)化一種已知質(zhì)粒,與此同時(shí),取一點(diǎn)感受態(tài)接種到含抗性的固/液體培養(yǎng)基培養(yǎng)來(lái)做對(duì)照。這樣第二天即可以知道這批感受態(tài)是否還有外源質(zhì)粒,又可以知道這批感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率的高低。如果合格,那以后就可以放心使用!因?yàn)槲乙苍?jīng)遇到其實(shí)是因?yàn)楦惺軕B(tài)不好而導(dǎo)致試驗(yàn)不成功,但是當(dāng)時(shí)不知道,結(jié)果費(fèi)時(shí)費(fèi)力。
    2
    、做克隆挑斑時(shí),我們可以在將沾有菌體的牙簽丟到試管前,在一塊相應(yīng)抗性的平板上點(diǎn)一下,標(biāo)注清楚,培養(yǎng)時(shí)間稍長(zhǎng)一點(diǎn),待長(zhǎng)成較大菌落后收取。以后需要哪一個(gè)菌,就在平板上挑取。這樣既方便快捷,又可以保證菌的一致。
    3
    、抽提質(zhì)粒時(shí),加入Sloution IIIII后要求輕柔混勻。我個(gè)人覺(jué)得不用這樣,只要不是非常劇烈,可以快速混勻。尤其可以運(yùn)用在一次抽提多管質(zhì)粒的時(shí)候,這樣可以快速,而且效果一點(diǎn)也不差。
    4
    、抽提質(zhì)粒時(shí),用無(wú)水乙醇沉淀的時(shí)間可以由實(shí)驗(yàn)操作者來(lái)決定,如果時(shí)間充??梢?span lang="EN-US">30min,否則8-10min也可以。至于溫度,個(gè)人覺(jué)得-20度好于常溫。如果加入可醋酸鈉,會(huì)較容易形成鹽類雜質(zhì),所以時(shí)間短一些更好!
    今天想到這些,先寫到這里,以后想到了在上來(lái)與大家分享。希望我的小經(jīng)驗(yàn)對(duì)大家有所幫助!
    37.
    首先聲明:實(shí)驗(yàn)中的一些技巧要用在首先對(duì)基本的操作有深刻了解的基礎(chǔ)上,在力求省時(shí)、省力、節(jié)約成本等的同時(shí),實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性是zui重要的。
    對(duì)大多數(shù)做蛋白的戰(zhàn)友們來(lái)說(shuō),培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)該是不陌生的,我這里談一個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞的小技巧,大家知道,對(duì)于一定的空間(如某種尺寸的細(xì)胞培養(yǎng)瓶)來(lái)說(shuō),細(xì)胞數(shù)目太多或者太少都不利于其生長(zhǎng),太多了就要消化,太少了要換一個(gè)小點(diǎn)兒的培養(yǎng)瓶,我的做法是:如果細(xì)胞數(shù)目太少,可以不必去找小一點(diǎn)兒的培養(yǎng)瓶,可把原來(lái)的培養(yǎng)瓶由原來(lái)的平放改為豎著放,這樣底部的空間就小了,有利于細(xì)胞的生長(zhǎng),當(dāng)細(xì)胞數(shù)目增加到一定程度的時(shí)候還可以在平過(guò)來(lái),避免了來(lái)回?fù)Q培養(yǎng)瓶而增加污染的機(jī)會(huì)(對(duì)沒(méi)有小培養(yǎng)瓶的更實(shí)用)。
    個(gè)人體會(huì),僅供參考。
    38.
    說(shuō)說(shuō)關(guān)于SDS-PAGE的幾個(gè)小經(jīng)驗(yàn)

    1
    、做好膠后,把所有的加樣孔都加上樣,這樣可以防止邊緣的樣品脫尾。

    2
    、高電壓/高電流電泳時(shí),可以把電泳槽放到4度冰箱中進(jìn)行電泳,省時(shí)省力,1hr搞定。

    3
    、膠考染時(shí)間40min,放在凝膠搖床上(沒(méi)有膠床可以放到28度普通搖床上,但要控制好搖床速度)緩緩搖動(dòng),使染色均勻,同時(shí)可提高檢測(cè)的靈敏度,根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)可以達(dá)到銀染的級(jí)別,就是脫色時(shí)間比較長(zhǎng),一般需要脫色23d,夏天的時(shí)候要勤換脫色液,防止變臭哦
    39.
    質(zhì)粒小提如果是用作鑒定或酶切,不必進(jìn)行酚仿抽提,將溶液1.2.3 離心后的清液移入一個(gè)新的1.5ml離心管中,再次離心3-5分鐘,小心取出上清液后,直接沉淀,不必?fù)?dān)心DNA切不開,我已經(jīng)這樣使用一年多,沒(méi)出過(guò)什么問(wèn)題。當(dāng)然這樣的質(zhì)粒不很干凈,但是做鑒定足夠了。尤其是實(shí)驗(yàn)室女同胞們,可以減少酚仿的侵害,而且節(jié)省時(shí)間。

     

     

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