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    真菌毒素檢測技術(shù)與產(chǎn)品服務(wù)（4）

    發(fā)布時間： 2009/3/27　　點擊次數(shù)： 2419次
    提 供 商： 研域（上海）化學(xué)試劑有限公司 資料大小：
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    相關(guān)產(chǎn)品：
    詳細(xì)介紹：

    液相色譜法對飼料中赭曲霉毒素的測定
     
    摘要：研究了液相色譜法測定飼料原料和配合飼料中赭曲霉毒素的方法。樣品經(jīng)已腈水（84：16）提取，提取液通過赭曲霉毒素凈化柱凈化、濃縮，C18色譜柱分離，熒光檢測器檢測，外標(biāo)法定量。對添加兩個濃度赭曲霉毒素的玉米樣品進行添加回收實驗，平均回收率為99.12%和103.09%，變異系數(shù)RSD分別為0.281%、1.214%，zui低檢測限為0.20ng/kg，方法簡便易行，準(zhǔn)確精密度高，值得推廣。
     
    Abstract: HPLC is applied to the determination of ochratoxin A in feed .The sample is extracted with 84/16 acetonitrile/water. Filtrace is cleaned up by ochratoxin purification column. Fluorescent ochratoxin A is separated on NovapakC18 column,and is detected by fluorescent detector and is quantified by external standard. Corn samples are fortified with    ochratoxin A at the twe levels. Five replicate analysis are performed each level. The recoveries of ochratoxin A are 99.30%~103.09%.The variation coefficients are 0.281%~1.214%.The detection limit is 0.20ng/kg. The precision and accuracy of this method are   satisfactory.
    Keywords: HPLC； pretreatment ； ochratoxin A
     
    霉菌遍布世界各地，種類繁多，依生活習(xí)性，分為倉儲霉菌和田間霉菌，前者指儲存原料和飼料在適宜的溫度、濕度下產(chǎn)生的霉菌，zui適宜溫度為25-30℃，相對濕度80-90%。赭曲霉毒素是溫暖地區(qū)zui重要的倉儲毒素，廣泛存在于玉米、大麥、小麥和飼料中,麩皮的污染高于整粒谷物。廣東地處亞熱帶，溫濕度十分適宜霉菌的生長，據(jù)有關(guān)調(diào)查該毒素污染在原料和配合飼料中普遍存在，陽性率大于60%2。赭曲霉毒素危害很大，致癌性*。據(jù)報道，每千克飼料中含有0.2-0.3克，就可使雞中毒，zui常見的臨床表現(xiàn)有：鈣磷吸收障礙，骨骼脆弱，蛋殼鈣化不全，破蛋率高，皮下出血，容易挫傷。對家畜主要攻擊腎臟、免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)，肝臟變得脆弱，劇渴，生長遲緩，多尿、下痢、糖尿癥。根據(jù)中國國家有關(guān)規(guī)定，赭曲霉毒素的zui高*為：20ug/kg.
    現(xiàn)常用的檢測方法多為薄層色譜和酶聯(lián)免疫法，薄層色譜法操作繁瑣，污染大、定量差，耗時長，而酶聯(lián)免疫法雖操作簡單，但存在假陽性，準(zhǔn)確性欠佳，此液相色譜法操作簡便，快速，準(zhǔn)確靈敏度高，不失為一種好方法。
    1.實驗部分：
    1.1試劑和儀器
    已腈（色譜純）冰醋酸（分析純）去離子水
    赭曲霉標(biāo)準(zhǔn)液  PuriToxSR 130赭曲霉毒素凈化柱  液相色譜儀 熒光檢測器
    1.2步驟
    1.2.1  取樣：取代表樣品5kg，粉碎，充分混合均勻，四分法縮至500g, 因霉菌毒素分布不均勻，充分混合非常重要，必要時取樣量加大，有地方建議取15kg。
    1.2.2  提取：取25g粉碎樣品于250ml三角燒瓶內(nèi)，加100ml已腈水（84：16），在振蕩器上振蕩1小時，用定量濾紙過濾。
    1.2.3  標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備：將50ul 10ug/ml 的赭曲霉毒素在一個棕色瓶子里吹干，用10ml的流動相進行溶解，渦旋1分鐘，此為50ng/ml的赭曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)液；另將1 ml10ug/ml
    的赭曲霉毒素在一棕色瓶子內(nèi)吹干，用10ml的流動相溶解，渦旋1分鐘，此為1ug/ml的赭曲霉加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。
    1.2.4   凈化濃縮：取7ml的樣品提取液用PuriToxSR 130赭曲霉毒素凈化柱，然后將凈化液轉(zhuǎn)移4ml的凈化液到另一試管，60℃水浴中氮氣吹干，用400ul的流動相（60/40/1水/已腈/已酸）溶解，渦旋30min ，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管內(nèi)10000轉(zhuǎn)離心5分鐘，轉(zhuǎn)移350ul 的清潔樣品進入液相。
     
    1. 3儀器條件
     
    Waters2695液相色譜儀，2475熒光檢測器
    色譜柱：NovapakC18（5um） 3.90*150mm   Waters PAHC18（5um）4.6*150mm
    流動相：60/40  水/已腈
    流速：0.5ml/min  運行時間：20min
    柱溫：40℃
    進樣體積：60ul
    EX:330nm      EM:460nm
     
    2.0測定結(jié)果
     
    2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程：取制定好的50ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動相分別稀釋成1、2、5、10、20、30、50ng/ml的濃度，上液相色譜進行檢測，根據(jù)檢測的峰面積對應(yīng)相應(yīng)濃度制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。相關(guān)系數(shù)為0.9995，回歸方程是Y=1.11×105X-1.85×103,檢測限：0.20ng/kg.
     
    表1.   標(biāo)準(zhǔn)曲線的基本參數(shù)：
    Tab.1 Regression equation
    濃度范圍
    Concn.Range（ng/ml）
    1.0
    2.0
    5.0
    10.0
    20.0
    30.0
    50.0
    峰面積
    Peak area
    103454.993
    210799.985
    515389.964
    1064099.926
    2285364.840
    3442139..760
    5463738.891
    相關(guān)系數(shù)
    Correlation
    0.9995
    回歸方程
    Regression equation
    Y=1.11×105X-1.85×103
    檢測限
    Limit of detection
    0.20ng/kg（按3倍信噪比計算）
     
     
     
    2.2不同濃度添加回收實驗：取玉米樣品1份，分別做兩個濃度的添加回收實驗，結(jié)果見表2。
    表2.兩個濃度的樣品添加回收實驗結(jié)果表：
    Tab.2 Recovery test
    組分
    Ingtedient
     
    本底值
    Known value
    （ng/ml）
    添加標(biāo)準(zhǔn)液的體積
    10ul
    35ul
    赭曲霉毒素
    0
    添加處理后理論濃度
    Added
    14.28ng/ml
    50.0ng/ml
    添加次數(shù)
    1
    2
    3
    4
    5
    1
    2
    3
    4
    5
    添加后測得濃度（ng/ml）
    Found
    14.18
    14.16
    14.13
    14.20
    14.10
    52.06
    52.16
    51.13
    51.68
    50.69
    回收率
    Recovery
    （%）
    99.30
    99.16
    98.95
    99.44
    98.74
    104.12
    104.32
    102.26
    103.36
    101.38
    平均值
    Average value
    99.12
    103.09
    RSD（%）
     
    0.281
     
    1.214
     
    2.3精密度實驗：選擇不同含量的玉米樣品兩份，分別平行測定8次，結(jié)果見表3
     
    表3.精密度實驗結(jié)果
    Tab.3 Precision test
    檢測次數(shù)
    1
    2
    3
    4
    5
    6
    7
    8
    平均值
    RSD
    樣品1測定值
    Sample 1 Found（ng/ml）
    11.23
    11.46
    11.41
    11.36
    11.87
    11.97
    11.67
    11.75
    11.59
    2.27
    樣品2測定值
    Sample 2 Found（ng/ml）
    28.57
    28.62
    28.68
    28.98
    28.87
    28.12
    28.92
    28.53
    28.66
    0.963
    3.0結(jié)論：
     

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